PCR de colônia

 

-         Transferir para um erlenmeyer o volume necessário de meio Terrific Broth (Life Technologies #22711-022) contendo ampicilina na concentração  final de 100 mg/ml (diluição 1:1000 de uma solução 100 mg/ml);

-         Distribuir 100 ml/poço em  microplacas de cultura;

-         Picar colônias brancas e isoladas com palitos estéreis e inocular os poços com meio;

-         Incubar em estufa a 37°C por aproximadamente 14 horas (até o meio ficar turvo com pouco sedimento de bactéria). Não ultrapassar mais do que 16 horas de incubação;

-         Após o período de incubação, adicionar 100 mL de glicerol 30% estéril por poço;

-         Preparar um mix para 100 reações de PCR em gelo:

 

Primer F (20 pmol/mL)	13,0 mL
Primer R (20 pmol/mL)	13,0 mL
dNTP (25mM)	7,5 mL
MgCl2 (50mM)	45,0 mL
10x Taq buffer	150,0 mL
Taq DNA pol (Biolase 5U/mL)	10,0 mL
H2O milli Q	1.261,5 mL
Total	15 mL/reação

 

-         Distribuir 15 mL do mix por poço na microplaca;

-         Flambar um replicador de 96 agulhas (Boekel) com álcool, colocá-lo na microplaca de cultura, misturar bem e transferir para placa de PCR (atentar  para a correta orientação das placas), misturar e flambar novamente;

-         Centrifugar a microplaca de PCR por 1 pulso até 700 g;

 

 

 

 

-         Colocar em termociclador e proceder com o seguinte programa:

95°C........4 min.

95°C........45 seg.

55°C........45 seg.       40x

72°C........1 min.

72°C........5 min.

4°C.........¥ min.

 

-         Preparar um gel de agarose 1,2% em TBE;

-         Em uma microplaca de plástico adicionar 3 ml da reação de PCR, 2 mL de H₂O milliQ e 1 mL de tampão de amostra 6x. Aplicar no gel duas fileiras de 8 amostras por microplaca;

-         Centrifugar por 1 pulso de 700 g, desnaturar as amostras a 65°C por 5 minutos e aplicar no gel (Sunrise 96 – Life Technologies). Correr a 100V por cerca de 30 minutos;

PCR de seqüenciamento

 

 

-         Diluir o DNA resultante do PCR de colônia 1:5 em água (60 ml por reação). As amostras previamente analisadas em gel devem ser diluídas com menor volume (48 ml por reação);

-         Homogeneizar as amostras;

-         Preparar um mix para 100 reações de PCR de seqüenciamento em gelo:

 

Primer F ou R (15,0 pmoles/mL)	200 mL
ABI BigDye Dye Terminator v.2	200 mL
2,5x dilution buffer	600 mL
H2O milliQ	700 mL
Total	17,0 mL/reação

 

 

-         Distribuir 17 mL do mix em cada poço de uma microplaca de PCR (ABI MicroAmp Optical 96 well Reaction Plate N801-0560) para seqüenciamento (especial para o ABI 3700);

-         Adicionar 3 mL de DNA do PCR de colônia em cada poço (já diluído 1:5), homogeneizando bem com a pipeta  multicanal antes e depois da transferência;

-         Centrifugar por 1 pulso a 700 g;

-         Tampar a microplaca com selo adesivo ou tampa de borracha;

-         Proceder ao PCR de seqüenciamento em termociclador ABI 9600 ou ABI 9700 (com rampagem lenta) segundo o programa abaixo:

 

96°C .......10 seg.

52°C …...20 seg.       40x

60°C ........4 min.

4°C .......... ¥

Remoção dos terminadores

 

-         Adicionar  20 mL de água por poço;

-         Adicionar 60 ml de isopropanol 100% por poço;

-         Homogeneizar vigorosamente;

-         Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente;

-         Centrifugar a microplaca a 3.000 g por 30 minutos (ou 1.200 g/ 50 minutos) a 20^oC;

-         Inverter a microplaca, descartar o sobrenadante e dar um pulso de centrifugação até 700 g com a microplaca invertida sobre papel absorvente;

-         Adicionar 150 mL de isopropanol 70% por poço. Não vortexar;

-         Centrifugar a microplaca a 3.000 g por 10 min. a 20^oC;

-         Inverter a microplaca, descartar o sobrenadante e dar um pulso de centrifugação até 700 g com a microplaca invertida sobre papel absorvente;

-         Secar a microplaca por 10 minutos em estufa a 37^oC para a evaporar o isopropanol residual;

-         Selar a microplaca com adesivo (ABgene Adhesive Plate Seal #AB-0580);

-         Armazenar a microplaca coberta por papel alumínio em freezer –20^oC até o momento do uso.

 

Apêndice

 

Primer F: CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC – 24-mer

Primer R: TTT CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC – 24-mer

2,5x dilution buffer: 200 mM Tris-Cl pH 9,0; 5,0 mM MgCl₂.