PCR de colônia

 

-         Transferir para um erlenmeyer o volume necessário de meio Terrific Broth (Life Technologies #22711-022) contendo ampicilina na concentração  final de 100 mg/ml (diluição 1:1000 de uma solução 100 mg/ml);

-         Distribuir 100 ml/poço em  microplacas de cultura;

-         Picar colônias brancas e isoladas com palitos estéreis e inocular os poços com meio;

-         Incubar em estufa a 37°C por aproximadamente 14 horas (até o meio ficar turvo com pouco sedimento de bactéria). Não ultrapassar mais do que 16 horas de incubação;

-         Após o período de incubação, adicionar 100 mL de glicerol 30% estéril por poço;

-         Preparar um mix para 100 reações de PCR em gelo:

 

Primer F (20 pmol/mL)	13,0 mL
Primer R (20 pmol/mL)	13,0 mL
dNTP (25mM)	7,5 mL
MgCl2 (50mM)	45,0 mL
10x Taq buffer	150,0 mL
Taq DNA pol (Biolase 5U/mL)	10,0 mL
H2O milli Q	1.261,5 mL
Total	15 mL/reação

 

-         Distribuir 15 mL do mix por poço na microplaca;

-         Flambar um replicador de 96 agulhas (Boekel) com álcool, colocá-lo na microplaca de cultura, misturar bem e transferir para placa de PCR (atentar  para a correta orientação das placas), misturar e flambar novamente;

-         Centrifugar a microplaca de PCR por 1 pulso até 700 g;

 

 

 

 

-         Colocar em termociclador e proceder com o seguinte programa:

95°C........4 min.

95°C........45 seg.       40x

55°C........45 seg.       40x

72°C...…...1 min.       40x

72°C........5 min.

4°C.........¥ min.

 

-         Preparar um gel de agarose 1,2% em TBE;

-         Em uma microplaca de plástico adicionar 3 ml da reação de PCR, 2 mL de H₂O milliQ e 1 mL de tampão de amostra 6x. Aplicar no gel duas fileiras de 8 amostras por microplaca;

-         Centrifugar por 1 pulso de 700 g, desnaturar as amostras a 65°C por 5 minutos e aplicar no gel (Sunrise 96 – Life Technologies). Correr a 100V por cerca de 30 minutos;