Preparo de bactérias eletrocompetentes

1. Semear bactérias em estrias por esgotamento a partir do estoque em glicerol numa placa de Petri contendo meio ágar LB com estreptomicina;

2. Cultivar durante noite em estufa a 37^oC;

3. Picar 1 colônia isolada com palito autoclavado e transferi-lo para um tubo Falcon estéril (15 mL) contendo 2-5 ml de meio LB;

4. Cultivar a 37^oC sob agitação a 300 rpm por 12 horas;

5. Utilizar o cultivo bacteriano como inóculo de 2 erlenmeyers de 500 mL contendo 100 mL de caldo 2-YT cada um (utilizar 1 mL como inoculo de cada frasco), e incubar a 37^oC sob agitação a 300 rpm;

6. Medir periodicamente a D.O.₆₀₀ e cultivar até um valor de 0,6;

7. Resfriar por 30 minutos no gelo;

8. Centrifugar as bactérias a 2.500 g por 5 minutos a 5^oC;

9. Ressuspender as bactérias em 100 mL de glicerol 10% gelado (50 mL por frasco) e centrifugar a 2.500 g por 5 minutos a 5^oC;

10. Ressuspender as bactérias em 50 mL de glicerol 10% gelado (25 mL por frasco) e centrifugar a 2.500 g por 5 minutos a 5^oC;

11. Ressuspender o conteúdo total de bactéria 1 mL de GTY gelado;

12. Distribuir alíquotas de 50 µL por tubo Eppendorf e colocar os tubos imediatamente em gelo seco.

13. Estocar a –80^oC até o momento do uso.

Eletroporação

1. Utilizar cubetas novas (BioRad 0,2 mm) ou reaproveitadas. No caso de utilizar cubetas reaproveitadas, irradiá-las imediatamente antes do uso em luz UV por 10 minutos. Mantê-las em gelo até o momento do uso;

2. Adicionar solução de glicose 1M ao meio SOB para uma concentração final de 20 mM (200 µL glicose em 10 mL de SOB) e deixar na estufa a 37ºC;

3. Colocar 2 µL da reação de ligação em 40 µL de suspensão de bactéria eletrocompetente;

4. Transferir a suspensão de bactérias para uma cubeta de eletroporação (0,1 ou 0,2 cm de largura) previamente resfriada em gelo e enxugar bem a parte externa da cubeta para remover a água de condensação. Não deixar resíduos de papel;

5. Colocar a cubeta nos eletrodos do eletroporador e proceder a um pulso de 2,5 kV com capacitância de 50 mF e resistência de 100 W (cubeta de 0,2 mm) ou 1,25 kV/50mF/100 W (cubeta de 0,1 mm) em aparelho BioRad modelo Gene Pulser II;

6. Adicionar imediatamente 600 µL de meio SOC, homogeneizar pipetando para cima e para baixo e transferir para um tubo Eppendorf;

7. Incubar em banho de água a 37°C por 1 hora;

8. Plaquear em meio ágar LB contendo antibiótico, X-Gal e IPTG;

9. Incubar em estufa a 37°C por cerca de 18 a 24 horas.

Apêndice

Lavagem das cubetas de eletroporação

1. Logo após o uso lavar com água para remover as bactérias;

2. Adicionar NaOH 1M até cobrir a parte metálica interna;

3. Completar com etanol e deixar por 10 min;

4. Enxaguar bem com água de torneira e depois com água MilliQ;

5. Secar em estufa a 37^oC;

6. Imediatamente antes do uso, esterilizar por 10 minutos em luz UV.

Obs: Se a parte externa da cubeta estiver oxidada, deixar de molho em solução de NaOH 1M e álcool.

2-YT

1,6 % (p/v) - bacto-triptona (16 g/L)

1,0 % (p/v) - extrato de levedura (10 g/L)

0,5% (p/v) - NaCl (5 g/L)

pH – 7,0

GTY

0,125% (p/v) - extrato de levedura (1,25 g/L)

0,215% (p/v) – triptona (1,25 g/L)

10% glicerol (v/v)

pH – 7,0

SOB

2% (p/v) - triptona (20 g/L)

0,5% (p/v) - extrato de levedura (5 g/L)

10 mM NaCl (0,59 g/L)

2,5 mM KCl (0,19 g/L)

10 mM MgSO₄ (9,52 g/L)

pH – 7,0

SOC

SOB + 20 mM glicose (a partir de solução mãe 1M esterilizada por filtração em membrana de 0,22 mm)

Placas LB ágar

1. Fundir ágar LB em forno de microondas;

2. Quando a temperatura baixar ao redor de 60°C (o frasco não queima em contato com a pele), adicionar ampicilina (solução 100 mg/mL) na diluição 1:1000 (100 µL de ampicilina para 100 mL de meio) para se atingir uma concentração final de 100 mg/mL;

3. Distribuir cerca de 25 mL de meio por placa de Petri pequena (90 mm de diâmetro) ou 60 mL por placa grande (160 mm), no fluxo laminar;

4. Antes do uso (~ 40 min), adicionar 20 µL de IPTG 100 mM e 100 µL de X-Gal 2%, espalhar por toda a placa com alça de Drigalski e guardar na estufa por no máximo 30 minutos.

IPTG ~ 100 mM (24 mg/ml)

1. Dissolver 0,24 g em 8 mL, acertar o volume para 10 mL, filtrar em membrana de 0,22 mm e distribuir alíquotas de 1 mL por tubo Eppendorf;

2. Estocar a -20°C.

X-Gal 2% (20 mg/ml)

1. Dissolver 0,2 g em 10 mL de dimetilformamida em capela de exaustão de gases);

2. Estocar a -20°C em frascos de VIDRO cobertos com papel alumínio.

Soluções de antibióticos

Antibiótico	Solução Mãe	Concentração de uso	Diluição
Ampicilina	100 mg/mL em água	100 mg/mL	1:1000
Carbenicilina	50 mg/mL em água	50 mg/mL	1:1000
Canamicina	10 mg/mL em água	30 mg/mL	1:333
Tetraciclina*	10 mg/ml em etanol 70%	30 mg/mL	1:333
Cloranfenicol	34 mg/ml em etanol	170 mg/mL	1:200
Estreptomicina	10 mg/ml em água	50 mg/mL	1:200

Obs. Soluções estoque de antibióticos dissolvidas em água devem ser esterilizadas por filtração em membrana de 0,22 mm, aliquotadas e estocadas a –20^oC. *Sensível à luz, manter em frasco escuro ou coberto de papel alumínio.