(pessoal de Xanthomonas sp faz estoque com o material a ser usado na Boiling prep)

• Agitar a placa inoculada para ressuspender as bactérias
• Adicionar 100µl de glicerol 30%/well (microplaca)
• Adicionar 100µl da cultura bacteriana/well
• Homogeneizar com pipeta

Selar com parafilm e estocar no freezer a -80ºC.

OBS: Fazer antes a solução de Stet-tween

• Após a retirada de material para o estoque, centrifugar a speed 2096; 3000 rpm; a 6ºC; por 10 minutos, aceleração 9 e desaceleração 4.
• Virar as placas para descartar o sobrenadante e dar leve "chacoalhada" para retirar excessos
• Deixar a placa virada descansando sobre papel higiênico por cerca de 5 minutos (no máximo).
• Observar e anotar o crescimento das bactérias
• Adicionar 25µl de água MilliQ estéril e vortexar bem até ressuspender o pellet (deve ficar uma solução mais ou menos branca).
• Adicionar o Stet-tween, 70µl por poço e vortexar levemente (tomar cuidado para não fazer espuma - é bom vortexar bem, tendo certeza de que está bem misturado, mas a espuma pode inativar a lisozima).
• Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente (para permitir a ação da enzima) com a placa tampada (ou com a tampa aberta dentro do microondas fechado).
• Tirar a tampa e aquecer no microondas de prato rotatório em potência máxima até começar a espumar (cerca de 45 segundos). Tomar cuidado para não borbulhar demais e misturar as amostras entre si.
• Inverter a posição da placa e ligar novamente o microondas até ferver (cerca de 10 segundos). Inverter a placa na direção longitudinal mais 2 vezes. Observar as bolhas.
• Adicionar 300µl de água MilliQ e vortexar por 15 segundos (misturar bem, mas evitar formar espuma).
• Colocar em gelo por 10 minutos.
• Centrifugar a 3000 rpm a 7ºC por 45 minutos.
• Transferir 50µl do sobrenadante para microplacas (Cuidado para não encostar no fundo que tem o pellet). Dica: Marcar a altura das ponteiras para aspirar o conteúdo .
• Etiquetar e datar.
• Estocar o DNA a -20ºC ou -80ºC (preferencialmente)

• Pesar 7,5 mg (ou 0,0075g) de lisozima (50 mg/10ml); freezer caixa 05 (lysozyme); e adicionar à solução de Stet-tween (15 ml) gelada.
• Adicionar RNAse 750µl à solução (RNAse 10mg/ml) - freezer ao lado da geladeira com cultura.
• Homogeneizar GENTILMENTE para não espumar (pois pode degradar a enzima)
• Colocar no gelo antes de usar.

Stet-tween

RNAse

• Dissolver RNAse pancreática em 0,01M de acetato de sódio (pH 5,2) para concentração de 10 mg/ml (usar 8 ml de acetato de sódio 0,01M e 0,08 g de RNAse)
• Aliquotar 683 µl
• Ferver por 15 minutos (100ºC)
• Esfriar em temperatura ambiente
• Ajustar o pH com 0,1 volume de Tris-Cl pH 7,5 1M
• Colocar 68,2µl de Tris em cada eppendorf

TB (Terrific Broth):

• 900 ml de água deionizada
• 12 g de bacto-triptona
• 24 g de extrato de levedura bacto. (bacto-yeast extract)
• 4 ml glicero

Volume final: 1 L

Misture os solutos até ficarem dissolvidos, esterilize na autoclave por 20 minutos. Com a solução a ~60ºC, coloque 100 ml da solução estéril de 0,17M KH₂PO₄; 0,72 K₂HPO₄. Depois de dissolvido tudo, ajuste o volume a 100 ml com água deionizada. Autoclavar por 20 minutos. 

OBS: solução 0,17M KH₂PO₄; 0,72 K₂HPO₄

• 2,31 g KH₂PO₄
• 12,54 g K₂HPO₄
• 90 ml água MilliQ