PCR de colônia
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PCR de colônia
 

• Transferir para um erlenmeyer o volume necessário de meio Terrific Broth (Life Technologies #22711-022) contendo ampicilina na concentração  final de 100 µg/ml (diluição 1:1000 de uma solução 100 mg/ml);

 
• Distribuir 100 µl/poço em  microplacas de cultura;

 
• Picar colônias brancas e isoladas com palitos estéreis e inocular os poços com meio;

 
• Incubar em estufa a 37°C por aproximadamente 14 horas (até o meio ficar turvo com pouco sedimento de bactéria). Não ultrapassar mais do que 16 horas de incubação;

 
• Após o período de incubação, adicionar 100 µL de glicerol 30% estéril por poço;

 
• Preparar um mix para 100 reações de PCR em gelo:

Primer F (20 pmol/µL)	13,0 µL
dNTP (25mM)	7,5 µL
MgCl2 (50mM)	45,0 µL
10x Taq buffer	150,0 µL
Taq DNA pol (Biolase 5U/µL)	10,0 µL
H2O milli Q	1.261,5 µL
Total	15 µL/reação

• Distribuir 15 µL do mix por poço na microplaca;
• Flambar um replicador de 96 agulhas (Boekel) com álcool, colocá-lo na microplaca de cultura, misturar bem e transferir para placa de PCR (atentar  para a correta orientação das placas), misturar e flambar novamente;
• Centrifugar a microplaca de PCR por 1 pulso até 700 g;

 
Colocar em termociclador e proceder com o seguinte programa:
 

95ºC..................... 4 min.
95ºC.....................45 seg. 55ºC.....................45 seg. 72ºC..................... 1 min.	40 X
72ºC..................... 5 min.
4ºC.....................

 

• Preparar um gel de agarose 1,2% em TBE;  
• Em uma microplaca de plástico adicionar 3 µl da reação de PCR, 2 µL de H₂O milliQ e 1 µL de tampão de amostra 6x. Aplicar no gel duas fileiras de 8 amostras por microplaca; 
• Centrifugar por 1 pulso de 700 g, desnaturar as amostras a 65°C por 5 minutos e aplicar no gel  (Sunrise 96 – Life Technologies). Correr a 100V por cerca de 30 minutos;