• Preparo de Bactéria Competente para Eletroporação (DH10B)
• Meios de Cultura
• Eletroporação
• Soluções de antibióticos (Maniatis pag. A6 vol 3)
  

Pré-inóculo:

• Estriar bactérias em glicerol (estoque) em placas LB agar + streptomicina;
• Crescer o/n;
• Picar 1 colônia isolada com palito autoclavado e colocar em falcon estéril com 2 ml de meio LB + streptomicina;
• Crescer o/n em shaker a 300 rpm/37°C.

• aliquotar 1 ml da bactéria crescida em 100 ml de 2YT (autoclavado);
• crescer no shaker 300 rpm/ 37°C/2 horas;
• Quando a DO atingir 0,6 - aceitável entre 0,6 e 0,7 - (600 nm)...
• Resfriar por 30 minutos no gelo;
• Centrifugar a 4000g por 15 minutos a 4°C
• Lavar 2x com 50 ml de glicerol 10% gelado;
• Centrifugar 4000g por 5 minutos entre as lavagens;
• Ressuspender em 250µL de GYT gelado;
• Aliquotar 40µL/eppendorf e jogar imediatamente no gelo seco.

Lembretes!

• Autoclavar 1 proveta de 50 ml para o glicerol
• Ligar a centrífuga antes para esfriar

2YT

• 3,2g bacto-tripona
• 2g extrato de levedura
• 1 g NaCl

acertar pH para 7,0
Vf: 200ml

GTY

• 10% glicerol
• 0,125% extrato de levedura
• 0,215% triptona

Vf = 10 ml

SOC = SOB + 20 mM glicose

SOB

• 2% triptona (2g)
• 0,5% extrato de levedura (0,5g)
• 10 mM NaCl (0,0585g)
• 2,5 mM KCl (0,01864g)
• 10 mM MgSO4 (0,09521g)

Vf: 100 ml

(fazer tudo no gelo)

• Irradiar cubetas que serão utilizadas por 15 minutos;
• Adicionar glicose (1M) ao meio SOB para ela ficar 20 mM (200 µL em 10 ml de SOB) e deixar a 37ºC;
• Colocar 2 µL de ligação em 40 µL de bactéria competente;
• Passar a bactéria para a cubeta e eletroporação (enxugar bem a cubeta e não deixar papel colado)
• Calibrar para 2,5V e apertar os dois botões vermelhos juntos ate apitar;
• Adicionar imediatamente 600 µL SOC, homogeneizar e passar para um eppendorf;
• Incubar em banho a 37°C por 1 hora
• Plaquear LB Agar com ampicilina (150 mg/ml) 1:1000?? + mix IPTG/X-Gal 1 IPTG:10 X-gal (100 µL/placa)
• Crescer o/n em estufa 37°C.

IPTG (200 mg/ml)

• Dissolver 2 g em 8 ml, acertar o volume para 10 ml, filtrar e aliquotar 1 ml/eppendorf;
• Estocar a -20°C.

X-Gal (20 mg/ml)

• Dissolver 0,2 g em 10 ml de dimetilformamida (capela);
• Estocar a -20°C coberto com papel alumínio

• soluções estoque de antibióticos dissolvidas em H₂O devem ser esterilizadas por filtração com filtro 0,22 micron.