• preparar gel de agarose 1,2% em TAE na cuba pequena (horizon 58), usando pente de oito dentes com espessura de 1,5 mm;
• completar volume do perfil para 20 µL e adicionar 4 µL do tampão de amostra 6x. Usar 3 µL de 100 bp;
• spin down
• desnaturar em banho 65°C por 5 min. Gelo. Aplicar no gel deixando um slot livre entre cada amostra;
• Eletroforese: 100V até o marcador separar as 800 pb iniciais
• Identificar tubos eppendorf e pesar;
• Separar as bandas dos perfis, fazendo size selection de acordo com cada perfil. Retirar o máximo possível de gel sem DNA, excluir bandas abaixo de 400 pb. Transferir os perfis no gel para os tubos pesados;
• Pesar os tubos com gel e subtrair o peso dos tubo vazio;
• Para cada 10 mg de gel, adicionar 10 µL do capture buffer do kit (máximo de 300 µL para 300 mg);
• Fechar o tubo e vortexar fortemente. Incubar à 65°C até a agarose dissolver (5-10 min), a gitando o tubo eventualmente;
• Durante a incubação, colocar uma coluna GFX em um tubo de coleta (do Kit) para cada purificação. Identificar os tubos e as colunas;
• Após a dissolução da agarose, centrifugar por um pulso os tubos (para coletar material da tampa);
• Transferir o conteúdo dos tubos para a coluna GFX. Incubar à temperatura ambiente por 1 minuto;
• Centrifugar em velocidade máxima por aproximadamente 35 segundos;
• Descartar o filtrado e colocar a coluna de volta ao tubo;
• Adicionar 500 µL de wash buffer do kit. Centrifugar em velocidade máxima por 35 segundos.;
• Descartar o filtrado e repetir centrifugação para retirada de todo o buffer. Descartar filtrado;
• Transferir as colunas para novos tubos de 1,5 ml identificados;
• Adicionar 40 µL de H₂OQ autoclavada em cada coluna. Incubar à temperatura ambiente por 1 minuto;
• Eluir o DNA centrifugando em velocidade máxima por 1 minuto;
• Aplicar 3µL do DNA eluído em gel de agarose para verificar purificação.

Blunting/Kinasing reaction (kit sure clone)

• adicionar reagentes e misturar levemente. Centrifugar por 1 pulso;
• Incubar em banho 37°C por 30 minutos;
• Adicionar 20µL de fenol + clorofórmio isoamílico 1:1 [clorofórmio + álcool isoamílico, 24 : 1] - ex: 100 µL fenol, 96µL clorofórmio e 4µL álcool isoamílico, vortexar e esperar separar fases;

• vortexar por 1 min. e centrifugar por 5 minutos a 12000 rpm;
• Coletar com cuidado a fase superior aquosa;
• Purificar usando coluna com Sephacryl do kit

Descongelar o tubo de sephacryl e agitar para ressuspender a resina;

Quebrar o tubo da coluna e colocar em tubo de 1,5 ml;

Adicionar 500 ml da resina ressuspendida na coluna;

Centrifugar os tubos em rotação máxima por 30 segundos;

Descartar o efluente e transferir a coluna para novo tubo identificado;

Aplicar a fase aquosa da reação (~ 18 µL) na coluna de sephacryl, no centro da resina;

Centrifugar a coluna por 1 minuto e guardar o tubo com o efluente a -20°C;

• Adicionar a amostra reparada em um novo tubo (0,5 ml) identificado;
• Adicionar o reagentes, misturar levemente e centrifugar por 1 pulso;
• A reação é feita em termociclador, tempratur 16°C por 16 horas (programa "Ligation", MJ minicycler)

Transformação

Placas LB ágar

• Fundir LB ágar no microondas
• Quando a temperatura estiver em torno de 60°C (não queima a pele), adicionar ampicilina (100 mg/ml), em diluição 1:1000 (100 µL de ampicilina para 100 ml de meio);
• Plaquear cerca de 60 ml de meio em placa grande, no fluxo;
• Antes do uso (~ 40 min) adicionar 30 µL de IPTG e 120 µL de X-Gal, espalhar por toda a placa e guardar na estufa por no máximo 30 minutos.

Lavagem das cubetas de eletroporação:

• Logo após o uso enxaguar com H₂O para retirar bactérias;
• Adicionar NaOH 1M até cobrir a parte metálica interna;
• Completar com etanol (volume máximo) e deixar por 10 minutos;
• Enxaguar bem com H₂O de torneira e depois com H₂OQ;
• Secar em estufa;
• Antes do uso, esterilizar por 10 minutos em luz UV.

Obs.: se a parte externa da cubeta estiver oxidada, deixar de molho em solução NaOH 1M e álcool.

PCR de Colônia

• Transferir para erlenmeyer o volume necessário de meio TB (100 µL/well). Adicionar ampicilina em diluição 1:1000 (10 µL de amp para 10 ml de meio)
• Distribuir o meio TB com ampicilina em placas de cultura : 100 µL por well;
• Picar colonias brancas e isoladas e colocar nos poços com meio;
• Deixar crescer em estufa a 37°C por aproximadamente 14 horas (até o meio ficar turvo com pouco sedimento de bactéria);
• Antes da PCR, adicionar 100 µL de glicerol 30% por poço;
• Identificar placa para PCR de colônia e preparar ficha de PCR;
• Preparar mix para 100 reações, em gelo;

• Distribuir 15 µL do mix com pipeta repetidora;
• Flambar repicador com álcool;
• Após esfriar, colocar repicador na plca de cultura, misturar bem, transferir para placa de PCR (observar a posição das placas) misturar e flambar novamente;
• Centrifugar por 1 pulso;
• Programa de PCR de colônia:

• Correr gel de agarose 1,2% em TBE;
• Em uma placa de plástico adicionar 2 µL de H₂OQ, 1 µL de tampão de amostra 6x e 3 mL de amostra de PCR (fileiras A e B);
• Marcador de PM 100 bp: 1 µL de 100 bp ladder, 4 µL de H₂OQ, 1 µL de tampão 6x;
• Centrifugar por 1 pulso;
• Desnaturar as amostras a serem aplicadas na agarose à 65°C por 5 minutos (programa do MJ: DENAT65);
• Eletroforese ~100V/~ 30 min.;
• Fotografar o gel.

PCR de seqüenciamento

• adicionar 4 volumes de H₂OQ (1:5) em cada well - ~ 48 mL de H₂OQ nas amostras que foram pro gel; ~60µL nas demais amostras;
• vortexar levemente para misturar;
• preparar mix para 100 reações, no gelo ( 2 tubos para cada placa)

• Distribuir 16 µL de mix em cada well da placa para sequenciamento (especial para o megabace);
• Transferir 4 µL de DNA (já diluído 1:5), homogeneizando bem com a multicanal antes e depois da transferência;
• Centrifugar por 1 pulso;
• programa:

• guardar em freezer -20°, protegendo as placas com papel alumínio.

Precipitação (lavagem de terminadores)

• Adicionar 2 µL de acetato de amônia 7,5M (do kit). Vortexar fortemente;
• Adicionar 2,5 volumes de etanol absoluto (58 µL de etanol 96%) à temperatura ambiente. Vortexar levemente;
• Incubar 15 minutos à temperatura ambiente;
• Contrabalancear as placas. Centrifugar à 3100 G por 30 min, à 22°C (ou 1200 G/ 50 min.);
• Inverter as placas na pia para descartar sobrenadante. Apoiar as placas invertida em papel;
• Colocar papel no suporte da centrífuga e a placa invertida. Ligar a centrífuga até atingir 500 rpm e desligar;
• Adicionar 200 µL de etanol 70% (preparado no momento de usar: 36,5 ml de etanol 96% para 50 ml de solução). Não vortexar;
• Centrifugar a 3100 G, por 10 min. À 22°C;
• Descartar o sobrenadante e centrifugar a placa invertida, como descrito acima;
• Adicionar 10 µL de loading buffer (do kit);
• Vortexar fortemente para dissolver o pellet;
• Centrifugar por 1 pulso;
• Guardar à -20°C, embrulhado em papel alumínio até sequenciar.

Gel de agarose

Cuba		Horizon 58	Horizon 11.14	Sunrise
Gel 4 mm	TBE (1x)	25 ml	65 mL	120 mL
	Brometo de etídio  10 mg/ml  (0,5ug/ml no gel)	1,25 µL	3,25 µL	6,0 µL
	Agarose 1 %	0,25 g(1,2%: 0,3 g)	0,65 g	1,2 g
	Agarose 1,5 %	0,375 g	0,975 g	1,8 g
	Agarose 2 %	0,5 g	1,3 g	2,4 g
Tampão de corrida	TBE 1x	250 ml	800 ml	900 ml
	Brometo de etídio 10 mg/ml	10 µL	40 µL	45 µL
Voltagem		100 V	130 V	145 V

Lavagem de Cubetas

• logo após o uso, enxaguar com H₂O para retirar bactérias;
• adicionar NaOH 1M té cobrir a parte metálica interna;  
• completar com etanol e deixar por 10 min;  
• enxaguar bem com H₂O de torneira e depois com H₂OQ;  
• secar em estufa;  
• antes do uso, esterilizar por 10 minutos em luz UV.