Protocolos de sequenciamento
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Preparação dos moldes de DNA
Boiling prep conforme protocolo distribuído pelos laboratórios centrais.

Análise dos DNAs
Duas fileiras (24 amostras) de cada microplaca são analisadas em gel de agarose 0,8% numa cuba Sunrise 96 (Life Technologies). A quantificação é feita utilizando-se o DNA Mass Ladder (Life Technologies #10068-013) como padrão de massa. Na realidade este teste somente é feito para estimarmos quantas amostras em média apresentam um rendimento de DNA adequado para o seqüenciamento e quantas falharam.

Reação de seqüenciamento
 
DNA molde  5,0 µl
Primer (1,6 pmoles/µl)  2,0 µl
Tampão 2,5 x  6,0 µl
BigDye mix  2,0 µl
H2O 5,0 µl
Total  20,0 µl

Tampão 2,5x : 200 mM Tris-Cl pH 9,0; 5 mM MgCl2

Condições de ciclagem: 

40 ciclos de: 
 

96oC 10 seg
52oC 20 seg
60oC 4 min


Lavagem dos terminadores
20,0 µl da reação
48,0 µl etanol absoluto (ou 50,0 µl de etanol 95%)
2,0 µl de acetato de sódio (3 M, pH 4,8)
 
1. Após a adição do etanol e acetato, vortexar bem para homogeneizar a solução (FUNDAMENTAL!)
2. Incubar 15 min temp. amb.
3. Centrifugar 45 min/~1300g ou 30 min/~3000 g 7 oC
4. Virar a placa e despejar o conteúdo
5. Centrifugar um pulso de alguns segundos com a placa invertida (não passar de 700 g)
6. Adicionar 150 ml de etanol 70% por well e vortexar alguns segundos.
7. Centrifugar 10 min (na máxima velocidade de qualquer centrífuga) 7 oC
8. Virar a placa e despejar o conteúdo
9. Centrifugar um pulso de alguns segundos com a placa invertida (não passar 700 g)
10. Repetir etapas 6 a 9
11. Adicionar 1,5 µl de loading buffer e vortexar muito bem (FUNDAMENTAL!)


Gel
Acrilamida 29:1 da BioRad (a partir de solução 40% feita no laboratório)

Aplicação no gel
Utilizar o método Sakabe (Perkin Elmer).
1. Colocar TBE 0,2x no compartimento superior (660 ml) e 1x no inferior (700 ml).
2. Iniciar pré-corrida e logo em seguida teclar pause
3. Lavar poços 1 ao 47 com seringa de insulina
4. Aplicar os poços ímpares do 1 ao 47 (0,75µ l da amostra).
5. Fazer a pré-corrida por 4 minutos.
6. Teclar pause e lavar os poços pares do 2 ao 48 e aplicar as amostras.
7. Aplicar o ladder fluorescente da Promega (0,75 µ l) no poço imediatamente anterior ao 1.
8. Fazer a pré-corrida por 4 minutos.
9. Teclar pause e lavar os poços ímpares do 49 ao 95 e aplicar as amostras.
10. Aplicar o ladder fluorescente da Promega (0,75 µl) no poço imediatamente posterior ao 96.
11. Fazer a pré-corrida por 4 minutos.
12. Teclar pause e lavar os poços pares do 50 ao 96 e aplicar as amostras.
13. Fazer a pré-corrida por 4 minutos.
14. Teclar pause e remover 49,5 ml do tampão superior e adicionar o mesmo volume de TBE 10x, homogeneizando bem. Para facilitar este procedimento, utilizar uma seringa de 60 ml. Tampar o compartimento superior.
15. Cancelar a pré-corrida e iniciar a corrida.


Análise dos resultados
Devido à aplicação do ladder, o tracker aponta como lane 1 o canal do ladder. Corrigir manualmente.

Corrigir quaisquer outros erros de tracking manualmente.

No sample manager, corrigir as posições de start point e peak 1 location de forma a remover os picos de terminadores. Reextrair os lanes de novo. Obs. Este procedimento é trabalhoso, mas permite melhorar sensivelmente a qualidade do cromatograma.

Ladder Fluorescente
Fluorescent Ladder (CXR) 60-400 Bases Promega #DG6221

Preparação: 0,5 µl do ladder + 1,5 µl de loading buffer
Desnaturar 90oC por 2 minutos
Aplicar 0,75 µl em cada poço periférico.

O intuito de se utilizar o ladder fluorescente nos poços imediatamente adjacentes aos poços 1 e 96 é para servir como referência para o posicionamento do primeiro e último poços de aplicação das amostras. Isto é especialmente importante se considerarmos que podem haver falhas de reação nos primeiros poços, dificultando a identificação pelo tracker, seja manual ou automaticamente. Com isto, procuramos evitar erros no tracking e de nomeação de todas as amostras, o que poderia prejudicar a montagem dos "scaffolds".

Imagem de um gel feito com o protocolo acima. Notar a presença do ladder fluorescente da Promega nos poços periféricos imediatamente adjacentes aos poços 1 e 96. Condições: placa de 36 cm, acrilamida 29:1 (BioRad), corrida longa de 7 horas, CCD gain = 2, aplicação individual com pipeta Gilson P2.