Protocolos de sequenciamento | |||||||||
Voltar | Home | Docentes | Equipe | Projetos | Bioinformática | Protocolos | Disciplinas | Serviços | Links |
DNA molde | 5,0 µl |
Primer (1,6 pmoles/µl) | 2,0 µl |
Tampão 2,5 x | 6,0 µl |
BigDye mix | 2,0 µl |
H2O | 5,0 µl |
Total | 20,0 µl |
Tampão 2,5x : 200 mM Tris-Cl pH 9,0; 5 mM MgCl2
Condições de ciclagem:
40 ciclos de:
96oC | 10 seg |
52oC | 20 seg |
60oC | 4 min |
Lavagem
dos terminadores
20,0 µl da reação
48,0 µl etanol absoluto (ou
50,0 µl de etanol 95%)
2,0 µl de acetato de sódio
(3 M, pH 4,8)
1.
Após a adição
do etanol e acetato, vortexar bem para homogeneizar a solução (FUNDAMENTAL!)
2.
Incubar 15 min temp. amb.
3.
Centrifugar 45 min/~1300g
ou 30 min/~3000 g 7 oC
4.
Virar a placa e despejar o
conteúdo
5.
Centrifugar um pulso de alguns
segundos com a placa invertida (não passar de 700 g)
6.
Adicionar 150 ml de etanol
70% por well e vortexar alguns segundos.
7.
Centrifugar 10 min (na máxima
velocidade de qualquer centrífuga) 7 oC
8.
Virar a placa e despejar o
conteúdo
9.
Centrifugar um pulso de alguns
segundos com a placa invertida (não passar 700 g)
10.
Repetir etapas 6 a 9
11.
Adicionar 1,5 µl de
loading buffer e vortexar muito bem (FUNDAMENTAL!)
Gel
Acrilamida 29:1 da BioRad (a partir
de solução 40% feita no laboratório)
Aplicação
no gel
Utilizar o método Sakabe
(Perkin Elmer).
1. | Colocar TBE 0,2x no compartimento superior (660 ml) e 1x no inferior (700 ml). |
2. | Iniciar pré-corrida e logo em seguida teclar pause |
3. | Lavar poços 1 ao 47 com seringa de insulina |
4. | Aplicar os poços ímpares do 1 ao 47 (0,75µ l da amostra). |
5. | Fazer a pré-corrida por 4 minutos. |
6. | Teclar pause e lavar os poços pares do 2 ao 48 e aplicar as amostras. |
7. | Aplicar o ladder fluorescente da Promega (0,75 µ l) no poço imediatamente anterior ao 1. |
8. | Fazer a pré-corrida por 4 minutos. |
9. | Teclar pause e lavar os poços ímpares do 49 ao 95 e aplicar as amostras. |
10. | Aplicar o ladder fluorescente da Promega (0,75 µl) no poço imediatamente posterior ao 96. |
11. | Fazer a pré-corrida por 4 minutos. |
12. | Teclar pause e lavar os poços pares do 50 ao 96 e aplicar as amostras. |
13. | Fazer a pré-corrida por 4 minutos. |
14. | Teclar pause e remover 49,5 ml do tampão superior e adicionar o mesmo volume de TBE 10x, homogeneizando bem. Para facilitar este procedimento, utilizar uma seringa de 60 ml. Tampar o compartimento superior. |
15. | Cancelar a pré-corrida e iniciar a corrida. |
Corrigir quaisquer outros erros de tracking manualmente.
No sample manager, corrigir as posições
de start point e peak 1 location de forma a remover os picos
de terminadores. Reextrair os lanes de novo. Obs. Este procedimento é
trabalhoso, mas permite melhorar sensivelmente a qualidade do cromatograma.
Ladder
Fluorescente
Fluorescent Ladder (CXR) 60-400
Bases Promega #DG6221
Preparação: 0,5 µl
do ladder + 1,5 µl de loading buffer
Desnaturar 90oC por 2
minutos
Aplicar 0,75 µl em cada poço
periférico.
O intuito de se utilizar o ladder fluorescente nos poços imediatamente adjacentes aos poços 1 e 96 é para servir como referência para o posicionamento do primeiro e último poços de aplicação das amostras. Isto é especialmente importante se considerarmos que podem haver falhas de reação nos primeiros poços, dificultando a identificação pelo tracker, seja manual ou automaticamente. Com isto, procuramos evitar erros no tracking e de nomeação de todas as amostras, o que poderia prejudicar a montagem dos "scaffolds".
Imagem de um gel feito com o protocolo
acima. Notar a presença do ladder fluorescente da Promega nos poços
periféricos imediatamente adjacentes aos poços 1 e 96. Condições:
placa de 36 cm, acrilamida 29:1 (BioRad), corrida longa de 7 horas, CCD
gain = 2, aplicação individual com pipeta Gilson P2.